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Y染色体微缺失检测方法的建立及应用研究 章钧

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发表于 2011-4-20 19:32 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 ranhaer 于 2011-4-23 08:43 编辑

作者: 章钧
学科专业: 人体解剖与组织胚胎学
授予学位: 博士
学位授予单位: 中山大学 中山大学
导师姓名: 何蕴韶
学位年度: 2008
语 种: chi
分类号: Q75 R394.3 Q-331
关键词: Y染色体缺失  无精子  荧光定量  PCR检测  毛细管电泳检测

本研究拟在建立特异性、高通量检测Y染色体微缺失方法的基础上再建立检测AZFb和AZFc区域重组的方法,为Y染色体微缺失及AZFb、AZFc区域研究及临床应用提供帮助。 目的:建立改良多重定性PCR方法用于Y染色体微缺失的临床检测,该方法比现有的方法采用更多的位点,能分辨不同类型的缺失。对无精子人群中进行检测,分析不同类型AZF的发病率。根据上述实验结果筛选出5个能够准确代表不同缺失部位的位点,组合成一套实时荧光定量PCR体系。利用实时荧光定量PCR技术所具有的快速、灵敏、特异等特点,作为Y染色体微缺失的筛查手段。 方法 1)通过NCBI序列数据库找到AZFa-c区段的DNA序列,挑选出位于a、b、c缺失区段内部及其间隔的22个位点,整合成5个改良多重定性PCR体系,使用硼酸盐缓冲液对PCR反应产物做快速电泳。分别采用欧洲男科学会推荐的多重定性PCR方法和本研究所建立的改良多重定性PCR方法在159例无精子患者中进行Y染色体微缺失。将两种方法获得的结果进行比较。 2)从以上实验结果筛选出位于不同区段的5个位点,建立实时荧光定量PCR.反应体系,使5对引物具有相同的扩增效率。对159例无精子病例采用本方法做Y染色体微缺失检测,比较改良多重定性PCR和实时荧光定量PCR检测的结果。 结论:本研究建立的改良多重定性PCR.方法能够有效地检测出Y染色体微缺失并细分缺失发生的区段,而且有潜力检测出现有方法无法分辨的缺失类型。而实时荧光定量PCR还具有更高的灵敏度和特异度,而且操作简便,适合作为一项初级筛查手段。 目的:建立Y染色体AZFb、AZFc区域不同重组类型的引物荧光PCR结合毛细管电泳检测方法,可以方便快捷且准确地区分出几乎所有的重组类型。采用PCR的方法合成及标记AZFc区域的荧光探针用于荧光原位杂交,作为引物荧光PCR结合毛细管电泳结果参考的金标准。分析无精子、少精子、反复流产无因与AZFb+c区域基因重组的关系。 方法:使用单拷贝序列PCR的形式针对red和green重复单元扩增PCR产物作为荧光原位杂交的探针,与Yql2探针同时杂交分析探针灵敏度和特异度。分析AZFc区域各重复单元,从中挑选出具有不同片段长度的同源序列来设计引物。引物要求能同时扩增出AZFc区域内同一重复序列间不同的重复单元和.AZFc区域以外的同源重复序列,同时这些PCR产物还具有不同的片段长度,可以用3100测序仪区分其片段大小及不同产物之间的产量比例。总共设计4对引物荧光PCR的引物在PCR反应后进行毛细管电泳,可用于区分18种AZFb+c区域内的不同重组类型。将引物荧光PCR结合毛细管电泳获得的结果与FISH结果进行比较。选取159例无精子症患者、72例少精子征患者和52例反复流产无因的病例使用引物荧光PCR结合细管电泳做检测,比较不同病例类型间不同重组类型的发生率。 结论:单拷贝序列PCR可用于荧光原位杂交探针的制备,具有低成本、高特异度、通用性广等优点。引物荧光PCR结合毛细管电泳方法可用于AZFb、AZFc区域各类重组的检测,具有快速、简便、高通量的通量等优点。Y染色体AZFb、AZFc区域重组是无精子和少精子的风险因素,但与反复流产无关。

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